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在微量滴定板中表達(dá)可溶性scFv

[器材和試劑]●用于細(xì)菌培養(yǎng)的96孔圓底微量滴定板（Nunc，目錄號(hào)62162）●含100ug/ml氨芐青霉素和0．1％葡萄糖的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/0．1％glu）●含100ug/ml氨芐青霉素和3mmol/LIPTG的2XTY培養(yǎng)基（2×TY/amp/glu/IPTG）（參見實(shí)驗(yàn)方案13．10）●噬菌體樣品[方法]1．用96孔無菌轉(zhuǎn)移設(shè)備或移液器從主板中，每孔取2ul；而后轉(zhuǎn)移至1個(gè)每孔含有100ul2×TY/amp/0.1％glu的無菌96孔微量滴定板中。2...

用PCR識(shí)別不同的噬菌體抗體克隆

[方法]1．配制PCR“主混合液”，每克隆20ulPCR混合液，包含：●水，15．5ul●10XRT緩沖液，2．0ul●5mmol／LdNTP，1．0ul●5，引物，1．0ul●3，引物，1．0ul●Taq聚合酶，0.2ul如果PCR緩沖液中不含Mg2+，這應(yīng)加至終濃度為1．5mmol／L。也可以使用與DNA聚合酶配套供應(yīng)的PCR試劑。2．取20fLl主混合液加到0．5m1管內(nèi)，或加入96孔PCR微孔板孔內(nèi)。3．用l根牙簽輕輕接觸單個(gè)克隆并在PCR反應(yīng)液中轉(zhuǎn)動(dòng)，注意不要轉(zhuǎn)移太...

再擴(kuò)增SCFvVLCDR3基因文庫

[器材和試劑]●PCR試劑和設(shè)備●WinardPCR純化試劑盒（Promega）●定制的DNA引物●VL—NotI引物（5，—GAGTCATTCTCGACTTGCGGCCGCACCTAGCACGGTCAGCTTGGTCCCTCCGCCGAACACCCAACC—3’）●LMB3引物●用于scFv基因文庫限制性消化的試劑和設(shè)備●已擴(kuò)增的scFv基因文庫DNA[方法]1．配制4個(gè)50ulPCR反應(yīng)混合液，包含：●去離子水，35．5ul●20×dNTP（每種5mmol/L），2．5u...

連接scFv和載體DNA并轉(zhuǎn)化大腸桿菌

[器材和試劑]●去離子水（millipore）●T4DNA連接酶和10×連接酶緩沖液（NEB）●16℃水浴●消化的scFv文庫DNA●pHENlDNA，用NcoI和NotI消化（100ng／ul）●電感受態(tài)大腸桿菌TGl細(xì)胞（Strataeene）●用于將scFv文庫電轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl株的試劑和設(shè)備[方法]1．配制1個(gè)50ul連接混合液，包含：●10×連接緩沖液，5uI●水，16ul●NcoI和NotI消化的pHENl（100g／ul），20ul●VcoI和NotI消化的...

平衡法選擇高親和力噬菌體抗體

1．多樣化的噬菌體抗體丈庫中制備噬菌體抗體。2．根據(jù)廠家說明，對(duì)抗原進(jìn)行生物素化。3．選擇前，在1個(gè)1．5m1微量離心管中．用2％MPBS1m1封閉150ul鏈霉親和素磁珠，室溫1小時(shí)。用磁性試管架將碰珠吸向一側(cè)。棄去緩沖液。4．用2％MPBS封閉3個(gè)1．5m1微量離心管，室溫1小時(shí)；而后，棄去封閉緩沖液。以3個(gè)不同濃度將士物素化抗原（總共3管）與溶于2％MPDS（終濃度）的1m1噬茼體樣品（大約1012c{u／m1）進(jìn)行孵育，室溫振蕩l小時(shí)。對(duì)于*輪選擇，抗原濃度應(yīng)分別為K...

用Biacore儀篩選解離速率較低的scFv

選擇3～5輪后，隨機(jī)挑取克隆加入96孔微量滴定板中并誘導(dǎo)表達(dá)可溶性scFv。然后，在包被有相關(guān)抗原的96孔微量滴定板中，用ELISA分析含有可溶性scFv的細(xì)菌上清。此過程可以識(shí)別出那些結(jié)合了抗原的scFv。但即便采用上述嚴(yán)謹(jǐn)性選擇后，ELISA陽性克隆中僅有部分克隆的親和力比野生型高。ELISA信號(hào)強(qiáng)度不能很好地顯示哪個(gè)克隆具有較低的Ka值，而且更為普遍的是它與scFv表達(dá)水平相關(guān)。因此，這就需要一種篩選ELISA陽性克隆的技術(shù)，能識(shí)別出具有較低Ka值的克隆。競(jìng)爭性或抑制性...

鞣酸—檸檬酸鈉還原法制備膠體金分散顆粒

A液（80ml）：1％氯化金，lml；雙重蒸餾水，79ml。B液（20m1）：1％檸檬酸鈉，4ml；1％單寧酸，0.lml；雙重蒸餾水，15．8ml。25mmol/LK2C03，0．1ml；將上述A液加熱到60℃，然后將B液快速加入到A液中，繼續(xù)攪拌，在極短的時(shí)間內(nèi)加熱到煮沸（大約10min），此時(shí)顏色由黑一藍(lán)一亮紅（近似紅葡萄酒顏色）變化。pH調(diào)到所需要求（根據(jù)所標(biāo)記蛋白質(zhì)種類的不同，所需的pH也不一樣）。上述用量合成的膠體金為10nm，根據(jù)所加入鞣酸（或稱單寧酸）量的不同...

制備膠體金分散顆粒的其他方法

乙醇—超聲波還原法（Baigent和Muller，1980）（1）取1％AuCl3·HCl水溶液lml加入100ml雙重蒸餾水。（2）用0．2m01/LK2C03調(diào)pH至7．2，再加入lml無水乙醇。（3）用20KC、135W超聲波探頭浸入溶液內(nèi)進(jìn)行超聲振蕩，此法制備的顆粒為6～10nm。硼氫化鈉還原法（Tschopp等，1982）（1）取0．6ml1％氯化金水溶液，加入40ml預(yù)冷（4℃）雙蒸餾水。（2）再加入0．2mol/LK2C030．2ml。（3）邊攪拌邊加入新鮮配制...