人血管內皮生長因子(VEGF)ELISA，產(chǎn)品編碼：JYM0103Hu

人血管內皮生長因子(VEGF)ELISA，Human vascular endothelial growth factor (VEGF)ELISA Kit

產(chǎn)品描述：

【實驗方法】雙抗體夾心法

【種屬】人

【檢測范圍】 見說明書

【檢測波長】450 nm

【樣本類型】血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本

【反應時間】 1.5~2h

人血管內皮生長因子（VEGF）酶聯(lián)免疫分析(ELISA)試劑盒使用說明書

本試劑盒僅供科研使用。

本試劑盒用于體外定量檢測人血清、血漿、組織、細胞上清及相關液體樣本中血管內皮生長因子（VEGF）的含量。

有效期：6個月

保存條件：2-8

實驗原理

本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中人血管內皮生長因子（VEGF）水平。用純化的人血管內皮生長因子（VEGF）抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入血管內皮生長因子（VEGF），再與HRP標記的血管內皮生長因子（VEGF）抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經(jīng)過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成很終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血管內皮生長因子（VEGF）呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人血管內皮生長因子（VEGF）濃度。

試劑盒組成

樣本處理及要求

1. 血清：室溫血液自然凝固 10-20 分鐘，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應再次離心。

2. 血漿：應根據(jù)標本的要求選擇 EDTA 或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合 10-20 分鐘后，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心 20 分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用 PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到 100 萬/ml 左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的 PBS，PH7.4。用液氮迅速冷         凍保存?zhèn)溆?。標本融化后仍然保?2-8℃的溫度。加入一定量的 PBS           （PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心 20 分鐘左右（2000-3000 轉/          分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不           能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

7. 不能檢測含NaN3 的樣品，因 NaN3 抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔 10 孔，在第一、第二孔中分         別加標準品 100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后          從第一孔、第二孔中各取 100μl 分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分        別加標準品稀釋液 50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各        取 50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋50ul，        混勻；混勻后從第五、第六孔中各取 50μl 分別加到第七、第八孔中，再在第             七、第八孔中分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取 50μl         加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液 50μl，混勻后從第九       第十孔中各取 50μl 棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為 50μl，濃度分別為                       300pg/ml, 200pg/ml, 100pg/ml, 50pg/ml , 25pg/ml。）

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、         待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液 40μl，然后再加待           測樣品10μl（樣品很終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不         觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標試劑 50ul，空白孔除外。

4. 溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

5. 配液：將 30(48T 的 20 倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30(48T 的 20 倍)倍稀釋后備         用。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30 秒后棄去，        如此重復 5 次，拍干。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑 A50ul，再加入顯色B50ul，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯        色 10 分鐘.

8. 終止：每孔加終止液 50ul，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

9. 測定：以空白孔調零，450nm 波長依序測量各孔的吸光度（OD 值）。 測定應在加終止液后 15 分鐘以內進行。

注意事項

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡 15-30 分鐘后方可使用，酶標包被板開封        后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2. 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3. 各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時          間很好控制在 5 分鐘內，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時做標準曲線，很好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本          OD值大于標準品孔第一孔的 OD 值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n             倍）后再測定，計算時請很后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6. 底物請避光保存。

7. 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

8. 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9. 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準.

計算

以標準物的濃度為橫坐標，OD 值為縱坐標，在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的 OD值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 OD 值計算出標準曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能

1. 樣品線性回歸與預期濃度相關系數(shù) R 值為 0.92 以上。

2. 批內與批間應分別小于 9%和 15%

檢測范圍

5pg/ml -400pg/ml

上海寶葉生物科技有限公司

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